مرکز تحقیقات میکروبیولوژی کاربردی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا... (عج(

مجله طب نظامي دوره 51 شماره 2 تابستان 5312 صفحات: 521-532 افزایش سرعت ترمیم عصب سیاتیک با مهار TNF-α توسط داروی اتانرسپت فاطمه بصیری MSc 5 عباسعلي ایماني فوالدی PhD 2 قاسم باقرپور MSc 2 حمیده محمودزاده حسیني MSc 2 چکیده معصومه فروتن کودهي MSc 3 محمدرضا نوراني 4* PhD تهران ایران گروه فیزیولوژی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا... (عج( 3 تهران ایران مرکز تحقیقات میکروبیولوژی کاربردی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا... (عج( 1 تهران ایران بخش مهندسی بافت مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی کاربردی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا... (عج( 1 تهران ایران 4 مرکز تحقیقات نانو بیوتکنولوژی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا... (عج( اهداف : متعاقب آسیب آکسونی در سیستم عصبی محیطی شبکه وسیع و پیچیدهای از سیتوکینها فعال میشوند که در راس این شبکه سیتوکین پیش التهابی TNF-α از اهمیت چشمگیری برخوردار است. به نظر میرسد غلظت باالی آن در سرعت ترمیم عصب محیطی تاثیر گذار بوده و احتمال افزایش سرعت ترمیم متعاقب استفاده از مهار کنندههای این پروتئین وجود دارد. روشها: در این مطالعه 331 سر موش صحرایی در دو گروه تجربی و کنترل دسته بندی شدند. بالفاصله بعد از ایجاد جراحت آکسونی 1/6 اتانرسپت به هر یک از رتها در گروه تجربی و همین مقدار نرمال سالین به هر یک از رتهای گروه کنترل به صورت داخل صفاقی تزریق شد. برای بررسی میزان شدت بیان ژن TNF-α رتها 3 و 1 روز 1 3 و 6 هفته بعد از جراحت و برای بررسی ایمنوهیستوشیمی و مورفولوژی 1 3 و 6 هفته بعد از جراحت مورد آزمایش قرار گرفتند. یافتهها: بیان ژن TNF-α 3 روز بعد از آسیب به عصب محیطی بطور چشمگیری افزایش مییابد. استعمال اتانرسپت در گروه تجربی بعد از جراحت این افزایش ناگهانی در میزان بیان ژن TNF-α را بطور معناداری کاهش میدهد (0.001< P ). در بررسی های ایمنوهیستوشیمی و مورفولوژی نیز ترمیم عصب در گروههای تجربی که در آنها پروتئین TNF-α توسط اتانرسپت مهار شده بود در مقایسه با گروه کنترل بهتر صورت گرفته است. نتیجهگیری: به نظر میرسد استفاده از آنتاگونیست TNF-α بعد از جراحت موجب مهار این پروتئین و تسریع ترمیم عصب میگردد. کلیدواژهها: TNF-α جراحت عصبی اتانرسپت * نویسنده مسئول: محمدرضا نورانی. پست الکترونیک: r.nourani@yahoo.com دریافت مقاله: 3133/1/13 پذیرش مقاله: 3131/5/5

316 فاطمه بصیری و همکاران مقدمه یکی از ضایعات متداول در جنگها آسیب به اعصاب محیطی باالخص عصب سیاتیک میباشد که متعاقب کار با اسلحه گرم دیده می شود. آسیب ناشی از برخورد گلوله به ناحیه ران به علت حرکت چرخشی و نوسانی بودن آن متفاوت از ضربات ناشی از اجسام تیز است ]3[. مطالعات اندکی در ارتباط با ترمیم عصب سیاتیک در مجروحین جنگی صورت گرفته است. دو مطالعه در طی جنگ جهانی دوم در آمریکا و استرالیا به ترتیب بر روی 3131 و 165 مجروح جنگی انجام شد که نتایج حاصل از جراحی انجام شده در این دو مطالعه مطلوب نبوده است. در مطالعه انجام شده توسط دکتر گوشه بر روی 643 جانبازان جنگ تحمیلی ایران- عراق که از آسیب عصب سیاتیک رنج میبردند از روش جراحی برای ترمیم استفاده شده است. اگرچه این روش نتایج مطلوبی را به همراه داشت ]1[ اما روش جراحی روشی مطمئن برای درمان قطعی بگونهای که شرایط بعد از ترمیم در حد کامال طبیعی باشد نیست] 1 [. نکته قابل توجه آن است که برخالف سیستم عصبی مرکزی فیبرهای عصبی محیطی قادر به بازسازی و عصبدهی هدفهای دیستال میباشند ]4[ و این پروسه ترمیم تقریبا بالفاصله بعد از جراحت آغاز میشود ]5, 6[ بنابراین شاید بتوان این فرضیه را مطرح نمود که درک مکانیزمهایی که تعدیلکننده- های اولیه ترمیم آکسونی جهت تنظیم رشد عصب بکار میبرند ممکن است برای بیان روشهایی جدید جهت تسریع و تقویت بازسازی عصبی مفید باشد ]7[. سیتوکینهای التهابی از قبیل factor-alfa(tnf-α) Tumor necrosis از جمله ترکیبات پاراکرینی هستند که میانجیگری تغییرات متابولیکی مذکور در سلول را بر عهده داشته و در پروسه های فیزیولوژیکال موضعی سهیم میباشند ]31-3[. TNF-α از جمله آغازکنندههای دژنراسیون والرین شناخته میشود ]33[ و آغازگر التهاب سیستمیک میباشد] 34-31 [ و متعاقب جراحت به آکسون عصب محیطی غلظت آن به میزان قابل توجهی افزایش مییابد ]7, 33-34[ 33, سلولهای شوان که به جراحت آکسونهای مجاور خود و ایسکمی حساس هستند ]6, 33[ 31, در پاسخ به چنین محرکهایی فعال شده و سیتوکین هایی مانند TNF-α را به عنوان یک عکس العمل به این استرسها تولید مینمایند ]33, 33[. این سیتوکین پیش التهابی نقش تاثیرگذاری در مراحل تخریب و ترمیم از خود نشان میدهند ]11[. وظیفه اصلی TNF-α تنظیم سلولهای ایمنی است. این ملکول میتواند مسبب بروز تب با منشأ درونی ایجاد آپوپتوزیس و مرگ تنظیم شده سلولی ایجاد عفونت همراه با اینترلوکین 3 واینترلوکین 6 ایجاد کاشکسی ایجاد التهاب مهار تومورزایی می- باشد,31[.]34 اختالل در میزان طبیعی TNF-α موجب بروز بیماریهایی همچون آلزایمر ]13[ سرطان ]11[ افسردگی ماژور] 11 [ و روده ملتهب ]14[ میشود. در مراحل اولیه کشتهای سلولی افزودن مجله طب نظامي دوزهای مشخصی از TNF-α موجب القای آپوپتوزیس سلولهای شوان میشود.در عین حال مهار سیگنالدهی متاثر از TNF-α به وسیله بلوک کردن فعالیت p38 آپوپتوزیس سلولهای شوان را کاهش میدهد ]15, 16[. تفاوت در بیان سطوح TNF-α و اثرات این ماده بر سلولهای شوان میتواند موجب تفاوت در سطوح بیماریهای دمیلینه کننده عصب مانند IDPC گردد ]31[. تولید TNF-α با دوز باال منجر به تشدید پاسخهای التهابی و اکسیداسیون میشود. در پاتوژنز بسیاری از بیماریها نظیر آرترواسکلروزیس نقش دارد ]31[. بطوریکه برداشت و حذف TNF-α اضافی از مکانهای التهاب یک هدف درمانی محسوب میشود ]17, 13[. تحقیقات جدید نشان میدهدکه TNF-α بر سرعت ترمیم عصب محیطی نیز اثر داشته و موجب کاهش سرعت ترمیم میگردد ]7, 13[. 31, در این پروژه ما قصد داریم ضمن بررسی تغییر در میزان بیان ژن TNF-α متعاقب آسیب به عصب محیطی و مهار TNF-α اثرات حاصله را بر ترمیم عصب محیطی مورد تجزیه و تحلیل قرار دهیم. روش ها تحقیق حاضر بر روی 51 سر موش صحرایی بزرگ ( تر ) نر بالغ نژاد ویستار به وزن تقریبا 111-151 گرم انجام شد. رت ها از مرکز تحقیقات انیستیتو پاستور تهران خریداری شدند و در مرکز حیوانات آزمایشگاهی یک دانشگاه علوم پزشکی تحت شرایط یکسان چرخهی 31 ساعت روشنایی و 31 ساعت تاریکی و در دمای 15-11 درجهی سانتی گراد نگهداری شدند آب و مواد غذایی در اختیار حیوانات قرار داده شد. رت ها به صورت تصادفی در گروههای کنترل و تجربی کالسه بندی شدند و هر گروه نیز به 5 زیر گروه طبقه بندی شده براساس 3 روز 1 روز 3 هفته 1 هفته و 6 هفته بود. هر زیر گروه نیز شامل 5 سر رت بود. برای بررسی موفولوژی و ایمنوهیستوشیمی فقط هفته اول سوم و ششم مورد آزمایش قرار گرفتند. روش جراحي: رتها را توسط داروی بیهوشی کتامین به مقدار 31 و گزیالزین 31 به صورت داخل صفاقی بیهوش نمودیم. برشی در پوست ناحیه باالیی ران و مجاورت عضله گلوتئوس در پای راست ایجاد نمودیم. عضله و فاسیا را به آرامی کنار زده و عصب سیاتیک را در فاصلهی بین بریدگی سیاتیک تا محل دو شاخهشدن اعصاب تیبیا و پروتئال مشترک نمایان نمودیم.عصب سیاتیک در 5 میلی متر پایین تر از بریدگی سیاتیک توسط فورسپس جولری به مدت 11 ثانیه کراش داده شد. محل کراش توسط تولوییدین بلو عالمت گذاری شد. عضله و پوست به آرامی در موقعیت آناتومیکی طبیعی خود قرار داده شدند و محل برش با نخ بخیه 1-5 سیلک دوخته شد و با بتادین % 31 رقیق شده ضد عفونی شد. به هر رت در گروه تجربی بعد از جراحت 1,6 اتانرسپت و در گروه کنترل به همان مقدار نرمال سالین به صورت داخل صفاقی تزریق شد. دوره 51 شماره 2 تابستان 5932

افزایش سرعت ترمیم عصب سیاتیک با مهار TNF-α توسط داروی اتانرسپت 317 سپس حیوان را در قفس تمیزی گذاشته شده و بعد از بهوش آمدن به قفس خود در حیوانخانه انتقال داده شد. بررسي میزان بیان ژن :TNF-α رت ها 3 و 1 روز 1 3 و 6 هفته بعد از جراحت قربانی شدند عصب سیاتیک آسیب دیده از بدن رت خارج شد و بالفاصله در محلول Trepure Isolation Reagent قرار داده شد. نمونهها در دمای 31- نگهداری شدند. بعد از انجام مراحل استخراج RNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر نانودراپ خلوص RNA استخراج شده تعیین شد.سپس از روی RNA استخراج شده (Bioneer) cdna می سازیم. فرایند نسخه برداری معکوس انجام شد واکنش PCR برای تکثیر ژن TNF-α ابتدا با آنزیمTaq پلی مراز) سیناژن (در غلظت 3 میکرولیتر MgCl 2 3 میکرولیتر از هر پرایمر 3 میکرولیتر, 1,5dNTPs میکرولیتر بافرx10 PCR در حجم 15 میکرولیترو دمای 71 صورت گرفت. چرخه های PCR شامل یک مرحله واسرشت شدن ابتدایی در دمای 35 به مدت 11 ثانیه اتصال پرایمر به رشته الگو در دمای 71 به مدت 11 ثانیه و تکثیر قطعه مورد نظر در دمای 71 به مدت 3 دقیقه و در پایان یک مرحله تکثیر نهایی در دمای 71 به مدت 5 دقیقه بود. محصول PCRبر روی ژل آگارور 1 %جداسازی شده و با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی شد و به وسیله دستگاه ترانس نام ژن TNF-α نوع پرایمر F جدول 5. توالی پرایمرها و اطالعات مربوط به آنها توالي پرایمر CCAGGAGAAAGTCCTCCT TCATACCAGGGCTTGAGCTCA TCATGAAGATCCTCACCGAG لومیناتور (UVIDOC) UVP قابل مشاهده و عکسبرداری گردید. با استفاده از نرم افزار Scion Image باندها مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. جهت بررسی و مقایسه و سنجش کیفیت cdnaسنتز شده و استفاده از آن به عنوان استاندارد وNormalizer پرایمرهای بتااکتین مربوط به ژن بتااکتین رت نیز طراحی و خریداری)سیناژن( شد (House-keeping.( geneبرای هر نمونه اصلی یک نمونه حاوی پرایمر بتا اکتین و با cdna الگو نمونه اصلی نیز PCR گذاشته شد. طراحي پرایمر ژن :TNF-α ابتدا توالی ژن TNF-α رت نژاد ویستار از سایت UCSC و NCBI گرفته شد و به کمک نرم افزار پرایمر تری طراحی پرایمر انجام شد. توالی نوکلئوتیدی پرایمر Forward و توالی نوکلئوتیدی پرایمر Revers مکمل ژنهای مورد نظر به صورت دستی طراحی و blast شد تا از اختصاصی بودن محل جفت شدن پرایمرها اطمینان حاصل گردد. نتایج جستجو نشان دادند که کلیه پرایمرها محل باند شدن منحصر به فردی را دارا میباشند. پرایمرها توسط شرکت Bioneer ساخته شدند. ترادف پرایمرهای بکار گرفته شده و نیز بهترین دمای annealing برای هر جفت پرایمر که از طریق گرادیان دمایی تعیین شده به شرح جدول 3 میباشد. دمای اتصال 173 71 R 331 53 F TTGCAATGGTGATGACCTG R Act-β در پایان شدت باندها با استفاده از نرم افزارImage Scion اندازه گیری شد. به منظور آنالیزهای آماری روش ANOVA و Chi- Square استفاده شد. بررسي مورفولوژی: تمام رتهای مربوط به این مرحله در پایان هفتهی سوم و ششم جهت انجام مطالعات بافت شناسی به وسیلهی اتر قربانی شدند. عصب سیاتیک را از انتهای محل ضایعه تا 5 میلیمترمربع از محل ضایعه بریده و نمونه تمام شب در ثابت کنندهی گلوتارآلدئید و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. پس از فیکس کردن بافتها با استفاده از درجات مختلف اتانول نمونهها آبگیری شدند. پس از این مرحله با استفاده از رزین )Germany,resin,812Epon( قالبگیری انجام شد. بعد از قالبگیری بلوکهای تهیه شده را توسط دستگاه اولترامیکروتوم ( ultracut-leica )به اندازه 511 نانومتر 1,5 میکرون برش زدیم و برشها را روی الم قرار دادیم. سپس با محلول تولوییدین بلو 3 درصد به مدت 1-1 دقیقه رنگ آمیزی نمودیم. پس از شستن در آب مقطر و خشک شدن الم ها با میروسکوپ نوری طول قطعه مورد نظر (JAPAN, 70 Olympus PROVIS Ax ) 411 بررسی شد ]11[. بیان بررسي پروتئین TNF-α و با بزرگنمایی با روش ایمونو هیستوشیمي: برشهای یخی از بیوپسیها با میکروتوم کرایواستات به ضخامت 11 میکرومتر تهیه و بر روی اسالیدهای پوشش داده شده با سیالن قرارگرفتند. اسالیدهای حاوی برشها را با آنتی بادی اولیه پلی کلونال خرگوش (abcam) با رقت 3:111 در دمای 4 و به مدت 31 ساعت آنتی بادی ثانویه انکوبه نموده و پس از شستشوی با PBS آن را به مدت 3 ساعت با آنتی بادی ثانویه Biotinilated Anti Rabbit Igg انکوبه کرده و سپس با سیستم اویدین-بیوتین و محلهای حضور کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی با DAB قابل رویت شده و با میکروسکوپ نوری مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. یافتهها بررسي بیان ژن TNF-α در عصب سیاتیک گروه کنترل و تجربي: پرایمرهای طراحی شده برای ژن TNF-α توانایی J Military Medicine Vol.15,No.2, Summer 2013

313 فاطمه بصیری و همکاران سنتز قطعاتی به طول 173 جفت بازی از ژن متناظر را داشت. هم زمان با انجام PCR برای ژن فوق پرایمر ژن بتا اکتین که قطعهای به طول 331 جفت بازی را سنتز می کردند استفاده شد. محصوالت حاصل از PCR-RT ژن TNF-α با روش الکتروفورزیز مورد بررسی قرار گرفتند. بیان ژن در نمونه نرمال قابل مشاهده نبود. بیشترین و قابل توجهترین میزان در 14 ساعت پس از آسیب دیده میشود در حالیکه در گروه تجربی افزایش بیان ژن مهار شده است. شدت بیان ژن در زمانهای 1 روز 3 هفته 1 هفته و 6 هفته بتدریج کاهش بیان را نشان میدهند. شدت باندهای TNF-α و ژن بتااکتین برای هر نمونه با استفاده نمودار 5. از نرم افزار Scion Image محاسبه کمی شد و نسبت میزان بدست آمده برای نمونه اصلی تقسیم بر میزان بدست آمده برای نمونه بتا اکتین معادل به عنوان شاخص شدت بیان ژن در نظر گرفته شد. برای مقایسه بیان این ژن در بین دو گروه تجربی و کنترل مربوط به هر بازه زمانی از آزمون test-t استفاده شد. بر اساس مقایسه شدت بیان ژن در بین گروهها مشاهده شد که میزان دانسیومتری در طی زمان بین گروههای مربوط به هر بازه زمانی به میزان معناداری با یکدیگر متفاوتند )1/113<P( خصوصا در 14 ساعت بعد از آسیب این تفاوت بسیار بارز میباشد )نمودار.)3 بررسی شدت بیان ژن TNF-α در بین گروه های تجربی و کنترل در بازه های زمانی 3 روز 1 روز 3 هفته 1 هفته و 6 هفته بر اساس نمودار فوق مصرف آنتاگونیست اتانرسپت بیان ژن مذکور باالخص پس از گذشت 14 ساعت در گروه تجربی افزایش معناداری را در مقایسه با گروه کنترل نشان میدهد )1/113<P( بررسي نتایج بافت شناسي عصب سیاتیک: نتایج بافت شناسی شامل بررسی میزان رژنراسیون آکسونها با میکروسکوپ نوری بود. نتایج میکروسکوپی نشان داد که گرچه در تمام گروهها اعم از کنترل و تجربی با گذشت زمان رژنراسیون بافتی صورت گرفته است اما تعداد آکسونها در گروههای مختلف متفاوت بوده و عمال در گروه 3 هفته ترمیم مشاهده نمیشود اما در هفته 1 و هفته 6 ترمیم مشهود است با این حال رژنراسیون در گروه تجربی 1 هفته بهتر از گروه کنترل 1 هفته میباشد اما در بین گروه تجربی 6 هفته و کنترل 6 هفته خیلی تفاوتی به چشم نمیخورد )شکل شماره 3 (. شکل 5. مورفولوژی عصب سیاتیک. تصاویر A,B,C,D,E,F به ترتیب مربوط به نمونه های نرمال کنترل 3 هفته کنترل 1 هفته تجربی 1 هفته کنترل 6 هفته و تجربی 6 هفته میباشد.نمونه های تجربی در مقایسه با نمونه های کنترل تفاوت قابل توجهی در میزان رشد عصب نشان میدهند. دوره 51 شماره 2 تابستان 5932 مجله طب نظامي

افزایش سرعت ترمیم عصب سیاتیک با مهار TNF-α توسط داروی اتانرسپت 313 بررسي یافتههای مربوط به آزمایشهای ایمنوهیستوشیمي: برشهای طولی تهیه شده از عصبهای سیاتیک گروههای کنترل و تجربی در 3 روز 1 هفته و 6 هفته پس از ایجاد آسیب با آنتی بادی مونو کلونال TNF-α رنگ آمیزی شدند. دربرش طولی نمونه کنترل عصب 3 روز پس از آسیب فیبرهای عصبی میلینی را بصورت دسته های منظم و موجی شکل نشان میدهد عکس العمل ایمنی در باالترین سطح قرار داشته است )شکل شماره 1(. شکل 2. تصویری از ایمونوهیستوشیمی بافت عصب سیاتیک. تصاویر,A,B,C,D,E F به ترتیب مربوط به نمونه های 3 روز کنترل 3 کنترل 1 هفته تجربی 6 هفته کنترل و بحث متعاقب جراحت آکسونی در فیبرهای سیستم عصبی محیطی فرایند تخریب والرین و ترمیم آکسونی به موازات یکدیگر و به صورت مستقل از هم آغاز میشود ]11[. در این راستا شبکه پیچیدهای از سایتوکاینها فعالیتهای پیاپی و منظم خود را آغاز میکنند که حضور به موقع و میزان معین هر یک از آنها مسبب بروز مرحلهای از واکنشها و در نتیجه پیشرفت مراحل متوالی فرایند می گردد ]34, 13-13, 11-11[. سایتوکاین پیش التهابی TNF-αاز جمله سایتوکاین های آغازگر این شبکه پیچیده می باشد ]11[. بگونهای که حضور این سایتوکاین سبب افزایش تولید سایر سایتوکاینهای التهابی در مراحل اولیه و کندی در سرعت ترمیم می شود ]7, 37[. 31, 31, بصورت تئوری با مهار- TNF αانتظار داریم تا پدیده ترمیم با سرعت بیشتری انجام گردد. در این پروژه از آنتاگونیست این مولکول استفاده شده است. مقایسه دادههای کمي بیان ژن TNF-α در نمونههای کنترل و تجربي: در این مطالعه ما ابتدا با روش PCR-RT بیان ژن TNF-α را بعد از جراحت در سطح ژنومیک در حضور اتانرسپت و بدون استفاده از اتانرسپت را مورد بررسی قرار دادیم. پاسخهای بدست آمده از تحقیق ما نشان میدهد که در گروه نرمال شدت میزان بیان ژن در حداقل مقدار خود میباشد بطوریکه شماش و همکارانش نیز نشان دادند که در حالت عادی روز تجربی 1 هفته 6 هفته تجربی می باشد.بر اساس نتایج بدست آمده با مصرف اتانرسپت به عنوان آنتا گروههای تجربی در مقایسه با کنترل در بازه زمانی یکسان کاهش نشان می دهد. گونیست تولید پروتئین TNF-α در میزان ژن TNF-α بسیار کم و به سختی قابل شناسایی میباشد ]31, 37[. میزان شناسایی شده به روش االیزا 6,51 پیکوگرم در 5 میلیگرم بافت مرطوب میباشد ]37[. متعاقب آسیب آکسونی میزان بیان ژن TNF-α در ناحیه جراحت افزایش مییابد ]6, 7, 14[. 36, بطوریکه یک ماکزیمم افزایش گذرا در 14 ساعت اول بعد از کراش مشاهده میشود و بعد از آن این میزان رو به کاهش دارد ]6, 37[ 7, و به مقدار نرمال نزدیک میشود که این تغییرات نشانه آسیب آکسونی میباشد ]7, 37[. در یافتههای ما نیز این تغییرات کامال مشهود است بطوریکه 3 روز بعد از کراش در گروه کنترل بیشترین میزان شدت بیان ژن به چشم میخورد که این افزایش ناگهانی و گذرا در شدت بیان ژن نشانه آسیب آکسونی است ]7, 14[. 13, 37, الفلر و همکارانش نیز نشان دادند جراحت به فیبرهای آکسونی در سیستم اعصاب محیطی موجب افزایش بیان ژن TNF-α در سیستم اعصاب محیطی موش ]36[ و رت ]35[ و در سلولهای شوان رت ]36, 14[ میشود و گزارشات کلینشونیتز و همکاران کاتو و همکاران شماش و همکاران و جرج و همکاران نیز مشابه یافتهای بدست آمده در تحقیق ما می باشد. از سویی دیگر شدت میزان بیان ژن در گروه تجربی 3 روز بعد از کراش که بالفاصله بعد از آسیب داروی اتانرسپت دریافت کردهاند بطور معناداری از گروه کنترل همزمان خود کمتر است. )1/15>P(. در سایر گروهها نیز بین گروه کنترل و تجربی تفاوت معناداری وجود دارد بطوریکه شدت میزان بیان ژن در گروه J Military Medicine Vol.15,No.2, Summer 2013

311 فاطمه بصیری و همکاران تجربی هر بازه زمانی بطور معناداری از شدت میزان بیان ژن در گروه کنترل همزمان با خود کمتر است میکند )1/113<P( با در نظر گرفتن نیمه عمر 1-5 روزه اتانرسپت ]31[ تجویز این دارو میتواند بر بیان ژن TNF-α اثر داشته باشد و موجب مهار بیان این ژن شود. یافتههای شاین نیز در سال 1116 مشابه همین یافتهها میباشد. بررسی روند تغییرات در طی زمان نشان میدهد که شدت میزان بیان ژن در گروه کنترل بعد از ماکزیمم افزایش روز اول رو به کاهش داشته و با گذشت زمان به مقدار نرمال نزدیک تر میشود اما همچنان تفاوت معناداری بین دو گروه کنترل و تجربی در هر بازه زمانی وجود دارد. (0.001>p). در اینجا نیز یافتههای ما از این الگو تبعیت میکند اما استعمال اتانرسپت در گروههای تجربی بطور معناداری بیان ژن را مهار نموده است. مقایسه دادههای حاصل از مورفولوژی: در مطالعات مورفولوژی نتایج بافتشناسی میزان رژنراسیون آکسونها با میکروسکوپ نوری بررسی شد. نتایج ماکروسکوپی نشان داد که گرچه در تمام گروهها اعم از کنترل و تجربی رژنراسیون بافتی صورت گرفته است اما تعداد آکسونها در گروههای تجربی قابل توجهتر از گروههای کنترل همزمان با خود میباشد )شکل 3(. به این ترتیب در نمونههای تجربی که با استفاده ازآنتاگونیست TNF-αیعنی اتانرسپت طبق جوابهای بدست آمده در ژنومیک و ایمنوهیستوشیمی کاهش میزان بیان ژن و ترشحTNF-α وجود دارد عمال تعداد آکسونهای رشد یافته بیشتر بوده و ترمیم قابل توجهتر میباشد.مارتین بندسزوس در 1114 نشان داد 14 ساعت بعد از جراحت تخریب آکسونی و میلین مشاهده میشود و یک هفته بعد اغلب فیبرها تخریب میشوند و ادم اندونوریال کامال مشهود است و 1 هفته بعد از جراحت ترمیم مشاهده می شود بطوریکه این روند تا هفته 6 تکمیل میگردد درحالیکه یافتههای ما نشان میدهد در نتیجه مهار بیان TNF-α ترمیم سریعتر میشود ]15[. گرچه بعد از آسیب در صورت حفظ تداوم لولههای اندونوریال معموال ترمیم به تدریج و در طی گذشت زمان امکان پذیر است اما در این پژوهش به نظر می رسد که در فواصل زمانی یکسان گروههایی که بالفاصله بعد از کراش از ازآنتاگونیست TNF-α یعنی اتانرسپت استفاده کردهاند از ترمیم بهتری برخوردار بودهاند. مجله طب نظامي مقایسه دادههای حاصل از ایمنوهیستوشیمي: از آنجاییکه نسخهبرداری ترجمه و ترشح سایتوکاینها میتواند پیرو مکانیزم- های متفاوتی باشد بگونهای که همواره بیان یک ژن لزوما به معنای سنتز پروتئین و سنتز پروتئین لزوما مشخصه ترشح آن نمی باشد ]13[ ما با استفاده از ایمنوهیستوشیمی به بررسی میزان حضور پروتئین TNF-α متعاقب کراش به عصب سیاتیک در حضور و عدم حضور اتانرسپت پرداختیم. نتایج ایمنوهیستوشیمی نیز کاهش قابل مالحظهای را در سطح بیان پروتئین TNF-α در گروه تجربی نسبت به گروه کنترل نشان میدهد که در اینجا نیز یک همخوانی میان mrna و ترشح پروتئین در ناحیه جراحت به دنبال استعمال آنتاگونیست مشاهده میشود. شماش و همکارانش نیز در 1114 نشان دادند که ترشح پروتئین- TNF αوجود دارد که با نتایج ایمنوهیستوشیمی بدست آمده همخوانی دارد. نتایج بدست آمده از آزمایشات ما نشان میدهد میزان بیان پروتئین در محل جراحت متعاقب استعمال اتانرسپت در گروه تجربی نسبت به گروه کنترل کاهش یافته است. نتیجهگیری با توجه به یافتهها به نظر میرسد استفاده از آنتاگونیست- TNF α بالفاصله بعد از جراحت موجب مهار اثرات ناشی از پیک غلظتی بیان TNF-α در 14 ساعت بعد از جراحت میگردد و نکته حائز اهمیت آن است که تاثیر مهار این پیک غلظتی در تسریع ترمیم عصب قابل توجه میباشد. بطوریکه در گروههای تجربی ترمیم بطور معناداری بهتر از گروههای کنترل میباشد. نکته قابل توجه دیگر این است که در این تحقیق تنها با استعمال یک دوز اتانرسپت بالفاصله بعد از کراش پیک افزایش میزان TNF-αکه 14 ساعت بعد از کراش دیده میشود مهار شده و به نظر میرسد مهار این مرحله باعث بروز نتایج مذکور گردیده است. بطوریکه اثرات ناشی از آن یعنی تسریع ترمیم حتی در هفته 1 و 6 بعد از کراش نیز پایدار بوده است. به نظر میرسد مهار اثرات ناشی از پیک ناگهانی تولید TNF-α در 14 ساعت بعد از کراش تاثیر چشمگیری بر فرایندهای متعاقب جراحت آکسونی دارد. منابع 1. Sanderland S. Nerve Injury and Repair. Edinburge: Churchil Livingston. 1999.p.183-6. 2. Goushe J, Beikpour H. Study of results from the treatment of sciatic nerve lesions in the lacerated of Iran-Iraq War. Pejouhandeh. 2005.p.362-5.[persian] 3. He C, Chen Z, Chen Z. Enhancement of motor nerve regeneration by nerve growth factor. Microsurgery. 1992;13(3):151-4. 4. Namiko A, Valeria C. Nerve injury signaling. Current opinion in Neurobiology. 2008;18(3):276-83. 5. Smith D, Tweed C, Fernyhough P, Glazner G. Nuclear factor-b activation in axons and Schwann cells in experimental sciatic nerve injury and its role in modulating axon regeneration: studies with Etanercept. Neuropathol Exp Neurol.2009;68(6):691-700. 6. Stoll G, Jander S, Myers RR. Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: from Augustus Waller's observations to دوره 51 شماره 2 تابستان 5932

افزایش سرعت ترمیم عصب سیاتیک با مهار TNF-α توسط داروی اتانرسپت 313 neuroinflammation. J Peripher Nerv Syst. 2002;7(1):13-27. 7. Kinshi K, Li H, Kikuchi S, Myers R, Shubayev V. Immediate Anti-tumor Necrosis Factor-a)Etanercept) Therapy Enhances Axonal Regeneration After Sciatic Nerve Crush. Neurosci Res. 2010;88(2):360-8. 8. Cao Z, Gao Y, Bryson JB, Hou J, Chaudhry N, Siddiq M, et al. The cytokine interleukin-6 is sufficient but not necessary to mimic the peripheral conditioning lesion effect on axonal growth. J Neurosci. 2006;26(20):5565-73. 9. Kleinschnitz C, Brinkhoff J, Zelenka M, Sommer C, Stoll G. The extent of cytokine induction in peripheral nerve lesions depends on the mode of injury and NMDA receptor signaling. J Neuroimmunol. 2004;149(1-2):77-83. 10. Temporin K, Tanaka H, Kuroda Y, Okada K, Yachi K, Moritomo H, et al. Interleukin-1 beta promotes sensory nerve regeneration after sciatic nerve injury. Neurosci Lett. 2008;440(2):130-3. 11. Gillen C, Jander S, Stoll G. Sequential expression of mrna for proinflammatory cytokines and interleukin-10 in the rat peripheral nervous system: comparison between immune-mediated demyelination and Wallerian degeneration. J Neurosci Res. 1998;51(4):489-96. 12. Myers RR, Campana WM, Shubayev VI. The role of neuroinflammation in neuropathic pain: mechanisms and therapeutic targets. Drug Discov Today. 2006;11(1-2):8-20. 13. Tracey D, Klareskog L, Sasso EH, Salfeld JG, Tak PP. Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: a comprehensive review. Pharmacol Ther. 2008;117(2):244-79. 14. Oppenhheim JJ, Feldman M. Introduction to the role of cytokines in innate and defense and adaptive immunity. In: Oppenhheim JJ, Feldman M, editors. Cytokine reference. New York: Academic; 2001. p 3 20. 15. Fleur ML, Underwood J, Rappolee D, Werb Z. Basement membrane and repair of injury to peripheral nerve: defining a potential role for macrophages, matrix metalloproteinases, and tissue inhibitor of metalloproteinases-1.j Exp Med. 1996;184:2311-26. 16. Taskinen HS, Olsson T, Bucht A, Khademi M, Svelander L, Roytta M. Peripheral nerve injury induces endoneurial expression of IFN-gamma, IL-10 and TNF-alpha mrna. J Neuroimmunol. 2000;102(1):17-25. 17. Shamash S, Reichert F, Rotshenker S. The cytokine network of Wallerian degeneration: tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1alpha, and interleukin-1beta. J Neurosci. 2002;22(8):3052-60. 18. Wagner R, Myers R. Schwan cells produce TNFalpha:Expression in injured and non-injured nerves. Neuroscience Research. 1996;73:625-9. 19. Bonetti B, Valdo P, Stegagno C, Tanel R, Zanusso GL, Ramarli D, et al. Tumor necrosis factor alpha and human Schwann cells: signalling and phenotype modulation without cell death. J Neuropathol Exp Neurol. 2000;59(1):74-84. 20. Navarro X, Verdu E, Buti M. Comparison of regenerative and reinnervating capabilities of different functional types of nerve fibers. Exp Neurol. 1994;129(2):217-24. 21. Locksley RM, Killeen N, Lenardo MJ. The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. Cell.2001;104(4):487-501. 22. Dowlati Y, Herrmann N, Swardfager W, Liu H, Sham L, Reim EK, et al. A meta-analysis of cytokines in major depression. Biol Psychiatry;67(5):446-57. 23. Brynskov J, Foegh P, Pedersen G, Ellervik C, Kirkegaard T, Bingham A, et al. Tumour necrosis factor alpha converting enzyme (TACE) activity in the colonic mucosa of patients with inflammatory bowel disease. Gut. 2002;51(1):37-43. 24. Mikocka-Walus AA, Turnbull DA, Moulding NT, Wilson IG, Andrews JM, Holtmann GJ. Controversies surrounding the comorbidity of depression and anxiety in inflammatory bowel disease patients: a literature review. Inflamm Bowel Dis. 2007;13(2):225-34. 25. Myers RR, Sekiguchi Y, Kikuchi S, Scott B, Medicherla S, Protter A, et al. Inhibition of p38 MAP kinase activity enhances axonal regeneration. Exp Neurol. 2003;184(2):606-14. 26. Lee JC, Kumar S, Griswold DE, Underwood DC, Votta BJ, Adams JL. Inhibition of p38 MAP kinase as a therapeutic strategy. Immunopharmacology. 2000;47(2-3):185-201. 27. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti- TNF antibody. Mol Immunol. 1993;30(16):1443-53. 28. Brennan FM, Chantry D, Jackson A, Maini R, Feldmann M. Inhibitory effect of TNF alpha antibodies on synovial cell interleukin-1 production in rheumatoid arthritis. Lancet. 1989;29;2(8657):244-7. 29. Dinarello C. IL-1: discoveries, controversies and future directions. Eur J Immunol. 2010;;40(3):599-606. 30. Donald DM, Cheng C, Chen Y, Zochodne D. Early events of peripheral nerve regeneration. Neuron Glia Boil. 2006;2(2):139-47. 31. Bruck W, Bruck Y, Friede RL. TNF-alpha suppresses CR3-mediated myelin removal by macrophages. J Neuroimmunol. 1992;38(1-2):9-17. 32. Rotshenker S. The cytokine network of wallerian degeneration. Curr Toopics Neurochem. 1997;1:147-56. 33. Shubayev VI, Myers RR.Upregulation and interaction of TNFalpha and gelatinases A and B in painful peripheral nerve injury. Brain Res. 2000;7;855(1):83-9. 34. George A, Buehl A, Sommer C. Wallerian degeneration after crush injury of rat sciatic nerve increases endo- and epineurial tumor necrosis factoralpha protein. Neurosci Lett. 2004;6;372(3):215-9. 35. Beendszus M, Wessig C, Solymosi L. MRI of peripheral nerve degeneration and regeneration: correlation with electrophysiology and histology. Exp Neurology. 2004;188(1):171-77 J Military Medicine Vol.15,No.2, Summer 2013

311 فاطمه بصیری و همکاران یادداشت: -------------------------------------------------------------------- ---------------------. دوره 51 شماره 2 تابستان 5932 مجله طب نظامي